Teknik mengukur pertumbuhan populasi mikroba

a. Berdasarkan jumlah sel

1. Metode langsung secara mikroskopis (Total count)

Ada beberapa cara perhitungan secara langsung, antara lain adalah dengan membuat preparat dari suatu bahan (preparat sederhana diwarnai atau tidak diwarnai) dan penggunaan ruang hitung (counting chamber). Enumerasi mikroba dapat dilakukan secara langsung yaitu dengan menghitung jumlahnya tanpa ditumbuhkan terlebih dahulu dalam suatu medium, dalam teknik ini semua sel mikroba baik yang hidup maupun yang mati akan terhitung. Untuk melakukan renumerasi mikroba dalam suatu bahan seringkali diperlukan pengenceran bertingkat.

a). Breed slide method

Pada metode ini tidak dibedakan sel yang hidup dan sel mati. Penghitungan dilakukan secara langsung pada setiap bidang pandang mikroskop. Sampel berupa cairan disebar (kira-kira 0,01 mL) pada microscope slide. Setelah dilakukan pewarnaan kemudian dilakukan penghitungan pada setiap bidang pandang mikroskop.

b). Petroff-Hauser chamber atau Haemositometer

Penghitungan secara langsung dapat dilakukan secara mikroskopis yaitu dengan menghitung jumlah bakteri dalam satuan isi yang sangat kecil. Alat yang digunakan adalah Petroff-Hauser Chamber atau Haemocytometer. Jumlah cairan yang terdapat antara coverglass dan alat ini mempunyai volume tertentu sehingga satuan isi yang terdapat dalam satu bujur sangkar juga tertentu. Dengan membuat preparat dari Suatu bahan (preparat sederhana diwarnai atau tidak diwarnai) dan penggunaan ruang hitung (counting chamber).

Ruang hitung terdiri dari 9 kotak besar dengan luas 1 mm². Satu kotak besar di tengah, dibagi menjadi 25 kotak sedang dengan panjang 0,2 mm. Satu kotak sedang dibagi lagi menjadi 16 kotak kecil. Dengan demikian satu kotak besar tersebut berisi 400 kotak kecil. Tebal dari ruang hitung ini adalah 0,1 mm. Sel nakteri yang tersuspensi akan memenuhi volume ruang hitung tersebut sehingga jumlah bakteri per satuan volume dapat diketahui.

2. Metode tidak langsung (viable count)

Perhitungan cara tidak langsung hanya untuk mengetahui jumlah mikroorganisme pada suatu bahan yang masih hidup saja (viable count). Metode perhitungan secara tidak langsung yang didasarkan pada anggapan bahwa setiap sel yang dapat hidup akan berkembang menjadi satu koloni yang merupakan suatu indeks bagi jumlah organisme yang dapat hidup yang terdapat pada sampel. Cara ini adalah cara yang paling umum digunakan untuk menentukan jumlah mikroba yang masih hidup, berdasarkan jumlah koloni yang tumbuh. Teknik ini diawali dengan pengenceran sampel secara seri, dengan kelipatan 1 : 10. Masing-masing suspensi pengenceran ditanam dengan metode tuang (pour plate) atau sebar (spread plate). Bakteri akan bereproduksi pada medium agar dan membentuk koloni setelah 18-24 jam inkubasi. Untuk menghitung jumlah koloni dalam cawan petri dapat digunakan alat ’colony counter’ yang biasanya dilengkapi dengan pencatat elektronik.

a). Spread plate method

Metode sebar (spread plate) merupakan metode penghitungan mikrobia pada medium padat. Dalam metode spread plate ini, volume kultur yang disebar tidak lebih dari 0,1 ml pada agar plate dan diratakan menggunakan alat yang disebut glass spreader. Kemudian plate diinkubasi sampai terlihat koloni sehingga jumlah koloni mikrobia dapat dihitung.  Walaupun mikrobia tertanam dalam agar plate, namun hasilnya sama dengan metode pour plate.

b). Pour plate method

Metode pour plate adalah metode agar cair yang digunakan untuk inokulasi dalam petri dish. Volume kultur yang biasa digunakan 0,1-1,0 ml. Kultur mikrobia dimasukkan ke dalam petri dish menggunakan pipet steril, kemudian medium agar yang telah dilelehkan (± 45 ^oC  dituangkan ke dalam petri dish yang telah berisi kultur mikrobia. Selanjutnya dilakukan pemutaran petri dish agar kultur mikrobia dan medium agar bercampur dengan rata. Koloni mikrobia akan tumbuh dan tertanam di dalam medium, baik di permukaan atas maupun di bawah. Sehingga metode pour plate ini cocok untuk menumbuhkan mikrobia anaerob.

c). MPN method

MPN adalah suatu metode enumerasi mikroorganisme yang menggunakan data dari hasil pertumbuhan mikroorganisme pada medium cair spesifik dalam seri tabung yang ditanam dari sampel padat atau cair yang ditanam berdasarkan jumlah sampel atau diencerkan menurut tingkat seri tabungnya sehingga dihasilkan kisaran jumlah mikroorganisme yang diuji dalam nilai MPN/satuan volume atau massa sampel.

Prinsip utama metode ini adalah mengencerkan sampel sampai tingkat tertentu sehingga didapatkan konsentrasi mikroorganisme yang pas/sesuai dan jika ditanam dalam tabung menghasilkaan frekuensi pertumbuhan tabung positif “kadang-kadang tetapi tidak selalu”. Semakin besar jumlah sampel yang dimasukkan (semakin rendah pengenceran yang dilakukan) maka semakin “sering” tabung positif yang muncul. Semakin kecil jumlah sampel yang dimasukkan (semakin tinggi pengenceran yang dilakukan) maka semakin “jarang” tabung positif yang muncul. Jumlah sampel/pengenceran yang baik adalah yang menghasilkan tabung positif “kadang-kadang tetapi tidak selalu”. Semua tabung positif yang dihasilkan sangat tergantung dengan probabilitas sel yang terambil oleh pipet saat memasukkannya ke dalam media. Oleh karena itu homogenisasi sangat mempengaruhi metode ini. Frekuensi positif (ya) atau negatif (tidak) ini menggambarkan konsentrasi mikroorganisme pada sampel sebelum diencerkan.

Asumsi yang diterapkan dalam metode MPN adalah :

1. Bakteri terdistribusi sempurna dalam sampel
2. Sel bakteri terpisah-pisah secara individual, tidak dalam bentuk rantai atau kumpulan (bakteri coliform termasuk E. coli terpisah sempurna tiap selnya dan tidak membentuk rantai).
3. Media yang dipilih telah sesuai untuk pertumbuhan bakteri target dalam suhu dan waktu inkubasi tertentu sehingga minimal satu sel hidup mampu menghasilkan tabung positif selama masa inkubasi tersebut.
4. Jumlah yang didapatkan menggambarkan bakteri yang hidup (viable) saja. Sel yang terluka dan tidak mampu menghasilkan tabung positif tidak akan terdeteksi.
5. MPN dinilai dari perkiraan unit tumbuh (Growth Unit / GU) seperti CFU (Colony Forming Unit), bukan dari sel individu. Meskipun begitu baik nilai CFU atau MPN dapat menggambarkan seberapa banyak sel individu yang tersebar dalam sampel. Metode MPN dirancang dan lebih cocok untuk diterapkan pada sampel yang memiliki konsentrasi <100/g atau ml. Oleh karena itu nilai MPN dari sampel yang memiliki populasi mikroorganisme yang tinggi umumnya tidak begitu menggambarkan jumlah mikroorganisme yang sebenarnya. Jika jumlah kombinasi tabung positif tidak sesuai dengan tabel maka sampel harus diuji ulang. Semakin banyak seri tabung maka semakin tinggi akurasinya tetapi juga akan mempertinggi biaya analisa

sumber : http://perpustakaancyber.blogspot.com/2012/11/pertumbuhan-mikroba-kurva-laju-lag-eksponensial-stasioner-bakteri-pengaruh-kecepatan.html